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服務目錄號:OGF-023
服務項目:對電離輻射危害有輔助保護作用
服務內(nèi)容:
原理
血/組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性降低是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現(xiàn)之一,在一 定范圍內(nèi),照射劑量與血/組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性成反比,恢復時間與血/組織中超氧化物歧 化酶(SOD)活性成正比,血/組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性可代表機體氧化還原反應系統(tǒng)受損的狀況。
O2-氧化羥基的最終產(chǎn)物為亞硝酸鹽,后者在對氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現(xiàn)紫紅色,在波長 530nm 處有最大吸收峰,可用分光光度法進行測定,當 SOD 消除 O2-后形成的亞硝酸鹽減少。
儀器與試劑
儀器 721 分光光度計、離心機、恒溫水浴、勻漿器 試劑
1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS) pH7.8、SOD 標準品、三氯甲烷、95%乙醇(v/v)、0.9%生理鹽水 10mmol/L 鹽酸羥胺 鹽酸羥胺 6.95mg,加 PBS 至 10mL 7.5mmol/L 黃嘌呤
黃嘌呤 11.41mg,加 0.1M NaOH 2.5mL 溶解,加 PBS 至 10mL 0.2mg/mL 黃嘌呤氧化酶
取 10mg/mL 黃嘌呤氧化酶 0.2mL 加冰冷 PBS 9.8mL 至 10mL 0.1%甲萘胺 取 0.2g α-甲萘胺溶于 40mL 沸蒸餾水,涼至室溫加 50mL 冰醋酸,再加 110mL 涼蒸餾水至 200mL 0.33%對氨基苯磺酸 取 0.66g 對氨基苯磺酸溶于 150mL 溫蒸餾水,加 50mL 冰醋酸至 200mL
實驗方法
實驗動物:小鼠,體重 18-22g,單一性別,每組 10-15 只。
劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設三個劑量組和一個輻射模型對照組,以人體推薦量的 10 倍為其中的一個劑量組,另設二個劑量組,必要時設陽性對照組。受試樣品于照射前給予 14-30 天,照射后仍然給予受試物,必要時可適當延長至 45 天。
實驗步驟
受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品,劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一 次,照射劑量宜選擇 6Gy-8Gy。于照射后第 7 天,進行實驗。
紅細胞抽提液制備:10μL 全血沖入 0.5mL 生理鹽水,2000r/min 離心 3min,棄上清,加冰冷的雙蒸水 0.2mL 混勻,加入 95%乙醇 0.1mL,振蕩 30s,加入三氯甲烷 0.1mL,置快速混合器抽提 1min,4000r/min 離心 3min,分層,上層為 SOD 抽提液,中層為血紅蛋白沉淀物,下層為三氯甲烷,記錄上清液體積待測。
組織勻漿的制備:剪取一定量的所需臟器,生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎,至玻璃勻漿器中加入 冷生理鹽水 20000r/min 勻漿 10s,間歇 30s,反復進行三次,制成 1%組織勻漿,(最好用超聲波發(fā)生器處理 30s),使線粒體振破,以中性紅-詹鈉氏綠 B 染色證明線粒體已振碎。以 4000r/min 離心 5min,取上清液 20μL待測。
SOD 標準抑制曲線 將 SOD 標準品用磷酸鹽緩沖液配制成 750U/mL 的溶液,再稀釋到 50 倍,即 SOD 量為 15U/mL(1.5μg/mL),用本法測定不同量的 SOD 標準液的百分抑制率,以百分抑制率為縱坐標,以 SOD 活力單位 U/mL 為橫坐標繪制標準曲線。
對照管 OD-測定管 OD
SOD 百分抑制率=────────────────×100%
對照管 OD
計算
每 mL 反應液中 SOD 抑制率達 50%時所對應的 SOD 量為一個單位。
(對照管 OD-測定管 OD) ×100%
對照管 OD
反應液總量(6mL)
SOD 活力(U/mL)=───────────────────────×──────────────×樣品稀釋倍數(shù)
50% 取液量
也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從 SOD 標準曲線查出相應的 SOD U/mL,乘以稀釋倍數(shù) (1mL/取樣量)。
若樣品為組織勻漿液,根據(jù)勻漿濃度或組織蛋白質(zhì)含量,將單位換算為 U/g 組織或 U/mg 蛋白。若樣品為紅細胞抽提液,根據(jù)血紅蛋白含量,可換算為 U/g Hb。
樣品測定步驟:
試劑 測定管 對照管
1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液 pH7.8(mL) 1.0 1.0
樣品 A*
10mmol/L 鹽酸羥胺(mL) 0.1 0.1
7.5mmol/L 黃嘌呤(mL) 0.2 0.2
0.2mg/mL 黃嘌呤氧化酶(mL) 0.2 0.2
雙蒸水(mL) 0.49 0.49
混勻,25℃恒溫水浴 20min
0.33%對氨基苯磺酸(mL) 2.0 2.0
0.1%甲萘胺(mL) 2.0 2.0
混勻 15min 后,倒入 1cm 光徑比色杯,以蒸餾水調(diào)零,530nm 處比色測定 OD 值。
* A 所用樣品的量
紅細胞抽提液 10 μL
血清(或血漿) 20-30 μL(溶血樣品剔除)
1%組織勻漿 10-40 μL
數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
SOD 活性值為計量資料,采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算 F 值,F 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。 任一劑量組與輻射模型對照組比較,血/組織中 SOD 活性增強,差異有顯著性,則可判定該實驗陽性。
血清溶血素實驗
原理
免疫系統(tǒng)是機體輻射損傷較敏感的組織之一,血清溶血素值可代表體液免疫系統(tǒng)的狀況。在一定范圍內(nèi),照射劑量與血清中溶血素水平成反比,恢復時間與血清中溶血素水平成正比,血清中溶血素可代表機體體液免疫系統(tǒng)受損的狀況。
實驗方法
實驗動物:小鼠,18-22g,單一性別,每組 10-15 只。
劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設三個劑量組和一個輻射模型對照組,以人體推薦量的 10 倍為其中的一個劑量組,另設二個劑量 組,必要時設陽性對照組。受試樣品于照射前給予 14-30 天,照射后仍然給予受試物,必要時可適當延長 至 45 天。
實驗步驟
受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品,劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射 一次,照射劑量宜選擇 1Gy-3Gy。于照射后 20 天內(nèi),進行血清溶血素的測定。(可任選下列方法之一)
血凝法
原理
用 SRBC 免疫動物后,產(chǎn)生抗 SRBC 抗體(溶血素),利用其凝集 SRBC 的程度來檢測溶血素的水平。
儀器和材料
SRBC、生理鹽水、微量血凝實驗板、離心機。
實驗步驟
SRBC 綿羊頸靜脈取血,將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中,朝一個方向搖動,以脫纖維, 放入 4℃冰箱保存?zhèn)溆?,可保?2 周。
免疫動物及血清分離 取羊血,用生理鹽水洗滌 3 次,每次離心(2000r/min)10min。將壓積 SRBC 用生理鹽水配成 2%(v/v)的細胞懸液,每只鼠腹腔注射 0.2mL 進行免疫。4~5 天后,摘除眼球取血于離心管內(nèi),放置約 1h,將凝固血與管壁剝離,使血清充分析出,2000r/min 離心 10min,收集血清。
凝集反應 用生理鹽水將血清倍比稀釋,將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內(nèi),每孔 100μL,再加入 100μL 0.5%(v/v)的 SRBC 懸液,混勻,裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋,于 37℃溫箱孵育 3h,觀察血球凝集程度。
血清凝集程度一般分為 5 級(0-IV)記錄,按下式計算抗體積數(shù),抗體水平=(S1+2S2+3S3……nSn) 式中 1、2、3……n 代表對倍稀釋的指數(shù),S 代表凝集程度的級別,抗體積數(shù)越大,表示血清抗體越高。
0 級 紅細胞全部下沉,集中在孔底部形成致密的圓點狀,四周液體清晰。
I 級 紅細胞大部分沉集在孔底成圓點狀,四周有少量凝集的紅細胞。
II 級 凝集的紅細胞在孔底形成薄層,中心可以明顯見到一個疏松的紅點。
III 級 凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層,中心隱約可見一個小紅點。
IV 級 凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層,凝塊有時成卷折狀。
數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
抗體積數(shù)為計量資料,采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算 F 值, F 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于模型對照組的抗體水平,可判定該項實驗結(jié)果陽性。
注意事項
血清稀釋時要充分混勻。最后一個稀釋度應不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。
半數(shù)溶血值(HC50)的測定
原理
用 SRBC 免疫動物后,產(chǎn)生抗 SRBC 抗體(溶血素),與 SRBC 一起孵育,在補體參與下,可發(fā)生溶血反應,釋放血紅蛋白,通過測定血紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的含量。
儀器和材料
721 分光光度計、離心機、恒溫水浴、SRBC、補體(豚鼠血清)、SA 緩沖液、都氏試劑(碳酸氫鈉 1.0g、 高鐵氰化鉀 0.2g、氰化鉀 0.05g,加蒸餾水至 1000mL)。
實驗步驟
SRBC 綿羊頸靜脈取血,將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個方向搖動,以脫纖維,放入 4℃冰箱保存?zhèn)溆?,可保?2 周。
制備補體 采集豚鼠血,分離出血清(至少 5 只豚鼠的混合血清),將 1mL 壓積 SRBC 加入到 5mL 豚鼠血清中,放 4℃冰箱 30min,經(jīng)常振蕩,離心取上清,分裝,-70℃保存。用時以 SA 液按 1∶8 稀釋。
免疫動物及血清分離 取羊血,用生理鹽水洗滌 3 次,每次離心(2000r/min)10min。將壓積 SRBC 用生理鹽水配成 2%(v/v)的細胞懸液,,每只鼠腹腔注射 0.2mL 進行免疫。4~5 天后,摘除眼球取血于離 心管內(nèi),放置約 1h,使血清充分析出,2000r/min 離心 10min,或 6000r/min,4min,收集血清。
溶血反應 取血清用 SA 緩沖液稀釋(一般為 200~500 倍)。將稀釋后的血清 1mL 置試管內(nèi),依次加入 10%(v/v)SRBC 0.5mL,補體 1mL(用 SA 液按 1:8 稀釋)。另設不加血清的對照管(以 SA 液代替)。置 37℃恒溫水浴中保溫 15~30min 后,冰浴終止反應。2000r/min 離心 10min。取上清液 1mL,加都氏試劑 3mL,同時取 10%(v/v)SRBC 0.25mL 加都氏試劑至 4mL,充分混勻,放置 10min 后,于 540nm 處以對照管作空白,分別測定各管光密度值。
溶血素的量以半數(shù)溶血值(HC50)表示,按下列公式計算,
樣品光密度值
HC50=───────────────────────×稀釋倍數(shù)
SRBC 半數(shù)溶血時的光密度值
數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
血清溶血素含量為計量資料,采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算 F 值,F 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。任一劑量組與輻射模型對照組比較,血清半數(shù)溶血值增多,差異有顯著性,則可判定該實驗陽性。
結(jié)果判定
在外周血中白細胞計數(shù)實驗、骨髓細胞 DNA 含量或骨髓有核細胞數(shù)實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗、血/組織中超氧化物歧化酶活性實驗、血清溶血素含量實驗中,任何兩項實驗結(jié)果陽性,可判定該受試樣品具有對電離輻射危害有輔助保護作用。
服務目錄號:OGF-023
服務項目:對電離輻射危害有輔助保護作用
服務內(nèi)容:
原理
血/組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性降低是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現(xiàn)之一,在一 定范圍內(nèi),照射劑量與血/組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性成反比,恢復時間與血/組織中超氧化物歧 化酶(SOD)活性成正比,血/組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性可代表機體氧化還原反應系統(tǒng)受損的狀況。
O2-氧化羥基的最終產(chǎn)物為亞硝酸鹽,后者在對氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現(xiàn)紫紅色,在波長 530nm 處有最大吸收峰,可用分光光度法進行測定,當 SOD 消除 O2-后形成的亞硝酸鹽減少。
儀器與試劑
儀器 721 分光光度計、離心機、恒溫水浴、勻漿器 試劑
1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS) pH7.8、SOD 標準品、三氯甲烷、95%乙醇(v/v)、0.9%生理鹽水 10mmol/L 鹽酸羥胺 鹽酸羥胺 6.95mg,加 PBS 至 10mL 7.5mmol/L 黃嘌呤
黃嘌呤 11.41mg,加 0.1M NaOH 2.5mL 溶解,加 PBS 至 10mL 0.2mg/mL 黃嘌呤氧化酶
取 10mg/mL 黃嘌呤氧化酶 0.2mL 加冰冷 PBS 9.8mL 至 10mL 0.1%甲萘胺 取 0.2g α-甲萘胺溶于 40mL 沸蒸餾水,涼至室溫加 50mL 冰醋酸,再加 110mL 涼蒸餾水至 200mL 0.33%對氨基苯磺酸 取 0.66g 對氨基苯磺酸溶于 150mL 溫蒸餾水,加 50mL 冰醋酸至 200mL
實驗方法
實驗動物:小鼠,體重 18-22g,單一性別,每組 10-15 只。
劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設三個劑量組和一個輻射模型對照組,以人體推薦量的 10 倍為其中的一個劑量組,另設二個劑量組,必要時設陽性對照組。受試樣品于照射前給予 14-30 天,照射后仍然給予受試物,必要時可適當延長至 45 天。
實驗步驟
受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品,劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一 次,照射劑量宜選擇 6Gy-8Gy。于照射后第 7 天,進行實驗。
紅細胞抽提液制備:10μL 全血沖入 0.5mL 生理鹽水,2000r/min 離心 3min,棄上清,加冰冷的雙蒸水 0.2mL 混勻,加入 95%乙醇 0.1mL,振蕩 30s,加入三氯甲烷 0.1mL,置快速混合器抽提 1min,4000r/min 離心 3min,分層,上層為 SOD 抽提液,中層為血紅蛋白沉淀物,下層為三氯甲烷,記錄上清液體積待測。
組織勻漿的制備:剪取一定量的所需臟器,生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎,至玻璃勻漿器中加入 冷生理鹽水 20000r/min 勻漿 10s,間歇 30s,反復進行三次,制成 1%組織勻漿,(最好用超聲波發(fā)生器處理 30s),使線粒體振破,以中性紅-詹鈉氏綠 B 染色證明線粒體已振碎。以 4000r/min 離心 5min,取上清液 20μL待測。
SOD 標準抑制曲線 將 SOD 標準品用磷酸鹽緩沖液配制成 750U/mL 的溶液,再稀釋到 50 倍,即 SOD 量為 15U/mL(1.5μg/mL),用本法測定不同量的 SOD 標準液的百分抑制率,以百分抑制率為縱坐標,以 SOD 活力單位 U/mL 為橫坐標繪制標準曲線。
對照管 OD-測定管 OD
SOD 百分抑制率=────────────────×100%
對照管 OD
計算
每 mL 反應液中 SOD 抑制率達 50%時所對應的 SOD 量為一個單位。
(對照管 OD-測定管 OD) ×100%
對照管 OD
反應液總量(6mL)
SOD 活力(U/mL)=───────────────────────×──────────────×樣品稀釋倍數(shù)
50% 取液量
也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從 SOD 標準曲線查出相應的 SOD U/mL,乘以稀釋倍數(shù) (1mL/取樣量)。
若樣品為組織勻漿液,根據(jù)勻漿濃度或組織蛋白質(zhì)含量,將單位換算為 U/g 組織或 U/mg 蛋白。若樣品為紅細胞抽提液,根據(jù)血紅蛋白含量,可換算為 U/g Hb。
樣品測定步驟:
試劑 測定管 對照管
1/15mol/L 磷酸鹽緩沖液 pH7.8(mL) 1.0 1.0
樣品 A*
10mmol/L 鹽酸羥胺(mL) 0.1 0.1
7.5mmol/L 黃嘌呤(mL) 0.2 0.2
0.2mg/mL 黃嘌呤氧化酶(mL) 0.2 0.2
雙蒸水(mL) 0.49 0.49
混勻,25℃恒溫水浴 20min
0.33%對氨基苯磺酸(mL) 2.0 2.0
0.1%甲萘胺(mL) 2.0 2.0
混勻 15min 后,倒入 1cm 光徑比色杯,以蒸餾水調(diào)零,530nm 處比色測定 OD 值。
* A 所用樣品的量
紅細胞抽提液 10 μL
血清(或血漿) 20-30 μL(溶血樣品剔除)
1%組織勻漿 10-40 μL
數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
SOD 活性值為計量資料,采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算 F 值,F 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。 任一劑量組與輻射模型對照組比較,血/組織中 SOD 活性增強,差異有顯著性,則可判定該實驗陽性。
血清溶血素實驗
原理
免疫系統(tǒng)是機體輻射損傷較敏感的組織之一,血清溶血素值可代表體液免疫系統(tǒng)的狀況。在一定范圍內(nèi),照射劑量與血清中溶血素水平成反比,恢復時間與血清中溶血素水平成正比,血清中溶血素可代表機體體液免疫系統(tǒng)受損的狀況。
實驗方法
實驗動物:小鼠,18-22g,單一性別,每組 10-15 只。
劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設三個劑量組和一個輻射模型對照組,以人體推薦量的 10 倍為其中的一個劑量組,另設二個劑量 組,必要時設陽性對照組。受試樣品于照射前給予 14-30 天,照射后仍然給予受試物,必要時可適當延長 至 45 天。
實驗步驟
受試樣品組于照射前后經(jīng)口連續(xù)給予受試樣品,劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射 一次,照射劑量宜選擇 1Gy-3Gy。于照射后 20 天內(nèi),進行血清溶血素的測定。(可任選下列方法之一)
血凝法
原理
用 SRBC 免疫動物后,產(chǎn)生抗 SRBC 抗體(溶血素),利用其凝集 SRBC 的程度來檢測溶血素的水平。
儀器和材料
SRBC、生理鹽水、微量血凝實驗板、離心機。
實驗步驟
SRBC 綿羊頸靜脈取血,將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中,朝一個方向搖動,以脫纖維, 放入 4℃冰箱保存?zhèn)溆?,可保?2 周。
免疫動物及血清分離 取羊血,用生理鹽水洗滌 3 次,每次離心(2000r/min)10min。將壓積 SRBC 用生理鹽水配成 2%(v/v)的細胞懸液,每只鼠腹腔注射 0.2mL 進行免疫。4~5 天后,摘除眼球取血于離心管內(nèi),放置約 1h,將凝固血與管壁剝離,使血清充分析出,2000r/min 離心 10min,收集血清。
凝集反應 用生理鹽水將血清倍比稀釋,將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內(nèi),每孔 100μL,再加入 100μL 0.5%(v/v)的 SRBC 懸液,混勻,裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋,于 37℃溫箱孵育 3h,觀察血球凝集程度。
血清凝集程度一般分為 5 級(0-IV)記錄,按下式計算抗體積數(shù),抗體水平=(S1+2S2+3S3……nSn) 式中 1、2、3……n 代表對倍稀釋的指數(shù),S 代表凝集程度的級別,抗體積數(shù)越大,表示血清抗體越高。
0 級 紅細胞全部下沉,集中在孔底部形成致密的圓點狀,四周液體清晰。
I 級 紅細胞大部分沉集在孔底成圓點狀,四周有少量凝集的紅細胞。
II 級 凝集的紅細胞在孔底形成薄層,中心可以明顯見到一個疏松的紅點。
III 級 凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層,中心隱約可見一個小紅點。
IV 級 凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層,凝塊有時成卷折狀。
數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
抗體積數(shù)為計量資料,采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算 F 值, F 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于模型對照組的抗體水平,可判定該項實驗結(jié)果陽性。
注意事項
血清稀釋時要充分混勻。最后一個稀釋度應不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。
半數(shù)溶血值(HC50)的測定
原理
用 SRBC 免疫動物后,產(chǎn)生抗 SRBC 抗體(溶血素),與 SRBC 一起孵育,在補體參與下,可發(fā)生溶血反應,釋放血紅蛋白,通過測定血紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的含量。
儀器和材料
721 分光光度計、離心機、恒溫水浴、SRBC、補體(豚鼠血清)、SA 緩沖液、都氏試劑(碳酸氫鈉 1.0g、 高鐵氰化鉀 0.2g、氰化鉀 0.05g,加蒸餾水至 1000mL)。
實驗步驟
SRBC 綿羊頸靜脈取血,將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個方向搖動,以脫纖維,放入 4℃冰箱保存?zhèn)溆茫杀4?2 周。
制備補體 采集豚鼠血,分離出血清(至少 5 只豚鼠的混合血清),將 1mL 壓積 SRBC 加入到 5mL 豚鼠血清中,放 4℃冰箱 30min,經(jīng)常振蕩,離心取上清,分裝,-70℃保存。用時以 SA 液按 1∶8 稀釋。
免疫動物及血清分離 取羊血,用生理鹽水洗滌 3 次,每次離心(2000r/min)10min。將壓積 SRBC 用生理鹽水配成 2%(v/v)的細胞懸液,,每只鼠腹腔注射 0.2mL 進行免疫。4~5 天后,摘除眼球取血于離 心管內(nèi),放置約 1h,使血清充分析出,2000r/min 離心 10min,或 6000r/min,4min,收集血清。
溶血反應 取血清用 SA 緩沖液稀釋(一般為 200~500 倍)。將稀釋后的血清 1mL 置試管內(nèi),依次加入 10%(v/v)SRBC 0.5mL,補體 1mL(用 SA 液按 1:8 稀釋)。另設不加血清的對照管(以 SA 液代替)。置 37℃恒溫水浴中保溫 15~30min 后,冰浴終止反應。2000r/min 離心 10min。取上清液 1mL,加都氏試劑 3mL,同時取 10%(v/v)SRBC 0.25mL 加都氏試劑至 4mL,充分混勻,放置 10min 后,于 540nm 處以對照管作空白,分別測定各管光密度值。
溶血素的量以半數(shù)溶血值(HC50)表示,按下列公式計算,
樣品光密度值
HC50=───────────────────────×稀釋倍數(shù)
SRBC 半數(shù)溶血時的光密度值
數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
血清溶血素含量為計量資料,采用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算 F 值,F 值<F0.05,結(jié)論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F 值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。任一劑量組與輻射模型對照組比較,血清半數(shù)溶血值增多,差異有顯著性,則可判定該實驗陽性。
結(jié)果判定
在外周血中白細胞計數(shù)實驗、骨髓細胞 DNA 含量或骨髓有核細胞數(shù)實驗、小鼠骨髓細胞微核實驗、血/組織中超氧化物歧化酶活性實驗、血清溶血素含量實驗中,任何兩項實驗結(jié)果陽性,可判定該受試樣品具有對電離輻射危害有輔助保護作用。