歐際醫(yī)藥依托擁有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行合作，為您提供主要包括模型制備、受試物給藥、標(biāo)本采集、功能指標(biāo)檢測(cè)等技術(shù)服務(wù)。

服務(wù)目錄號(hào)：#OGF-002

服務(wù)項(xiàng)目：有助于抗氧化

服務(wù)內(nèi)容：

1.選用10 月齡以上老齡大鼠或 8 月齡以上老齡小鼠，也可用氧化損傷模型鼠。

2.推薦用單一性別，小鼠每組10－15 只，大鼠 8－12 只。

3.實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)溶劑對(duì)照組，以人體推薦量的10 倍（小鼠）或 5 倍（大鼠）為其中的一個(gè)劑量組，另設(shè)兩個(gè)劑量組，高劑量一般不超過 30 倍，必要時(shí)設(shè)陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組。受試樣品給予時(shí)間30 天，必要時(shí)可延長(zhǎng)至 45 天。

4.器/體重比值測(cè)定：胸腺/體重比值，脾臟/體重比值。

5.結(jié)果判定：3 個(gè)劑量組給予不同濃度受試樣品，對(duì)照組給予同體積溶劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物測(cè)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

客戶提供：受試樣品、陽性對(duì)照品

歐際提交：詳細(xì)研究報(bào)告

服務(wù)周期：3個(gè)月

服務(wù)目錄號(hào)：#OGF-002-1

模型名稱：D －半乳糖氧化損傷模型

D-半乳糖供給過量，超常產(chǎn)生活性氧，打破了受控于遺傳模式的活性氧產(chǎn)生與消除的平衡狀態(tài)，引起過氧化效應(yīng)。選 25－30g 健康成年小鼠，除空白對(duì)照組外，其余動(dòng)物用 D-半乳糖 40mg－1.2g/kg BW 頸背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量為 0.1mL/10g，每日 1 次，連續(xù)造模 6 周，取血測(cè) MDA，按 MDA 水平分組。隨機(jī)分為 1 個(gè)模型對(duì)照組和 3 個(gè)受試樣品劑量組，3 個(gè)劑量組經(jīng)口給予不同濃度受試樣品，模型對(duì)照組給予同體積溶劑，在給受試樣品的同時(shí)，模型對(duì)照組和各劑量組繼續(xù)給予相同劑量 D-半乳糖頸背部皮下或腹腔注射，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物測(cè)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

服務(wù)目錄號(hào)：#OGF-002-2

模型名稱：乙醇氧化損傷模型

乙醇大量攝入，激活氧分子產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致組織細(xì)胞過氧化效應(yīng)及體內(nèi)還原型谷胱甘肽的耗竭。選25－30g 健康成年小鼠（180－220g 大鼠），隨機(jī)分為 4 個(gè)組，1 個(gè)模型對(duì)照組和 3 個(gè)受試樣品劑量組，必要時(shí)可增設(shè) 1 個(gè)空白對(duì)照組。3 個(gè)劑量組給予不同濃度受試樣品，模型對(duì)照組給予同體積溶劑，連續(xù)灌胃

30 天，末次灌胃后，模型組對(duì)照組和 3 個(gè)劑量組禁食 16 小時(shí)（過夜），然后 1 次性灌胃給予 50%乙醇 12mL/kgBW，6 小時(shí)后取材（空白對(duì)照組不作處理，不禁食取材），測(cè)血清或肝組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量、蛋白質(zhì)羰基含量、還原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

服務(wù)目錄號(hào)：#OGF-002-3

模型名稱：脂質(zhì)氧化產(chǎn)物測(cè)定

血中過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量可采用熒光法和比色法測(cè)定，方法任選其一。

將10nmol/mL 四乙氧基丙烷，用雙蒸水稀釋成 0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL 分別取0.1mL 加入酸水解液 2mL、TBA 工作液 0.5mL→混勻，避光、沸水浴 60min→流水冷卻至室溫→3mL 正丁醇振蕩抽提 1min→3000r/min 離心 5min→取上清液（正丁醇層）測(cè)熒光強(qiáng)度（入射狹縫 1.5nm，出射狹縫 5nm，

激發(fā)波長(zhǎng)536nm，發(fā)射波長(zhǎng) 550nm）以四乙氧基丙烷濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖。

服務(wù)目錄號(hào)：#OGF-002-4

模型名稱：比色法

MDA（malondiadehycle）是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，測(cè)其含量可間接估計(jì)脂質(zhì)過氧化的程度。1 個(gè)丙二醛（MDA）分子與 2 個(gè)硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性條件下共熱，形成粉紅色復(fù)合物。該物質(zhì)在波長(zhǎng) 532nm 有極大吸收峰。可用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。組織勻漿樣品：取一定量的所需臟器，生理鹽水沖洗、拭干、稱重、剪碎，置勻漿器中，加入 0.2M 磷酸鹽緩沖液，以 20000r/min 勻漿 10s，間歇 30s，反復(fù)進(jìn)行 3 次，制成 10%組織勻漿（W/V），3000r/min 離心5－10min，取上清液待測(cè)。

服務(wù)目錄號(hào)：#OGF-002-5

模型名稱：蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物測(cè)定

H 2 O 2 或 O 2 ·ˉ自由基對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的氧化可導(dǎo)致羰基產(chǎn)物的積累。羥自由基也可直接作用于肽鏈，使肽鏈斷裂，引起蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，在斷裂處產(chǎn)生羰基。羰基化蛋白極易相互交聯(lián)、聚集為大分子從而降低或失去原有蛋白質(zhì)的功能，蛋白質(zhì)羰基含量可直接反映蛋白質(zhì)損傷的程度。蛋白質(zhì)羰基形成是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標(biāo)志，它隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。

取0.1g 組織，在冰的生理鹽水中漂洗，以去掉表面的血跡。加入 0.9mL 的冰的 10 mmol/L HEPES 緩沖液（pH7.4），制成 10%的勻漿。將勻漿液以 3000r/min 的轉(zhuǎn)速，離心 10 min，保留上清。取 100g/L 的硫酸鏈霉素溶液 50μL，加入上清液 450μL（v/v,1:9），室溫放置 10 min 后，以 11000r/min 的轉(zhuǎn)速，離心 10 min，取上清液待測(cè)。

服務(wù)目錄號(hào)：#OGF-002-6

模型名稱：抗氧化酶活力測(cè)定

SOD 催化超氧陰離子自由基（O 2 ·ˉ）生成 H 2 O 2 ，再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶作用生成水，這樣可以清除 O 2 ·ˉ對(duì)細(xì)胞的毒害作用。SOD、GSH-Px 在動(dòng)物某些器官和人體血紅細(xì)胞中的含量均有明顯的增齡變化，酶活性與生物年齡的增長(zhǎng)成反比。消除自由基的能力與酶活性成正比。1.3.6.1 血或組織中超氧化物歧化酶（SOD）活力測(cè)定。

溶血液：取鼠血10μL 加入到 1mL 雙蒸水中，充分振搖，使之全部溶血 1:100 待測(cè)，4h 內(nèi)測(cè)定酶活力。若當(dāng)天來不及測(cè)定，將肝素抗凝全血置-20℃凍存，3d 內(nèi)測(cè)定，若 4℃存放，28h 內(nèi)必須測(cè)完。測(cè)前取出樣品室溫自然解凍。

組織上清液：動(dòng)物禁食過夜，處死后，立即取出所需臟器，放入冷生理鹽水中洗去浮血，剔除脂肪及結(jié)締組織，濾紙吸干后，在冰浴上剪成碎塊，稱取適量組織，加冷0.2M 磷酸緩沖液，以 20000r/min 勻漿 10s，間歇 30s，反復(fù) 3 次制成 5%組織勻漿，操作在冰浴中進(jìn)行，勻漿以 12500×g 離心 10min（低溫高速離心機(jī)），

以沉淀為破碎的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、核及線粒體，上清液用以測(cè)胞液中的酶活力，最好當(dāng)天測(cè)，否則加20%（v/v）甘油分裝于塑料管，放置-20－-80℃，可保存數(shù)周，而酶活力不減。1.3.6.2.3.2 GSH 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取 1.0mmol/LGSH 溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于 10mL 小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀劑 8mL，用雙蒸水稀釋至 10mL 刻度，即得到濃度為 0、20、40、60、80、100μmol/L 的 GSH 標(biāo)準(zhǔn)液。取上述不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液各 2mL，放入試管中，加入 0.32mol/L Na 2 HPO 4 2.5mL，比色前加入 DTNB 顯色液 0.5mL 用光徑 1cm 杯，5min 內(nèi)在可見光 423nm 波長(zhǎng)測(cè) OD 值，以雙蒸水調(diào)零點(diǎn)。以 GSH 含量（μmol/L）為橫坐標(biāo)，OD 423 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

服務(wù)目錄號(hào)：#OGF-002-8

模型名稱：抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽（GSH）

谷胱甘肽是一種低分子清除劑，它可清除O 2 - 、H 2 O 2 、LOOH。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽，是組織中主要的非蛋白質(zhì)的巰基化合物，是 GSH-Px 和 GST 兩種酶類的底物，為這兩種酶分解氫過氧化物所必需，它能穩(wěn)定含巰基的酶，和防止血紅蛋白及其它輔助因子受氧化損傷，缺乏或耗竭 GSH會(huì)促使許多化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境因素產(chǎn)生中毒作用，GSH 量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。

溶血液上清液：取0.1mL 抗凝全血加雙蒸水 0.9mL（1：9 溶血液），充分混勻，直至透亮為止。取溶血液 0.5mL 加 4%磺基水楊酸 0.5mL 混勻，室溫下 3500rpm 離心 10 分鐘，取上清液備用。血清上清液：取 0.1mL 血清加 4%磺基水楊酸 0.1mL 混勻，室溫下 3500rpm 離心 10 分鐘，取上清液備用。組織上清液：取組織 0.5g 加生理鹽水 4.5mL 充分研磨成細(xì)漿（10%肝勻漿），混勻后取漿液 0.5mL 加 4%磺基水楊酸 0.5mL 混勻，室溫下 3500rpm 離心 10 分鐘，取上清液備用。

服務(wù)目錄號(hào)：#OGF-002-9

模型名稱：血中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px ）活力測(cè)定

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是體內(nèi)存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的系統(tǒng)。對(duì)防止體內(nèi)自由基引起膜脂質(zhì)過氧化特別重要，其活力以催化 GSH 氧化的反應(yīng)速度，及單位時(shí)間內(nèi) GSH 減少的量來表示，GSH 和 5，5’-二硫?qū)ο趸郊姿幔―TNB）反應(yīng)在 GSH-Px 催化下可生成黃色的 5-硫代 2-硝基苯甲酸陰離子，于 423nm 波長(zhǎng)有最大吸收峰，測(cè)定該離子濃度，即可計(jì)算出 GSH 減少的量，由于 GSH 能進(jìn)行非酶反應(yīng)氧化，所以最后計(jì)算酶活力時(shí)，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的 GSH 減少。

溶血液：取血20μL 加入到 1mL 雙蒸水中，充分振搖，使之全部溶血 1:100 待測(cè)，4 小時(shí)內(nèi)測(cè)定酶活力。若當(dāng)天來不及測(cè)定，將肝素抗凝全血置-20℃凍存，3 天內(nèi)測(cè)定，若 4℃存放，28 小時(shí)內(nèi)必須測(cè)完。測(cè)前取出

樣品室溫自然解凍。